АЛК АГАТ

Набор предназначен для качественного и количественного определения 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) в моче в клинико-диагностических и биохимических лабораториях. АЛК является важным диагностическим маркером отравления свинцом. Кроме того, значительное повышение уровня АЛК в моче может наблюдаться при патологических процессах, связанных с нарушением порфиринового обмена (порфириях). Набор рассчитан на проведение 100 качественных или 15 количественных определений. 

АЛК реагирует с метилацетоацетатом при нагревании с образованием пиролла, который селективно экстрагируется этилацетатом. При взаимодействии пиролла в сильнокислой среде с п-диметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) образуется окрашенное в красный цвет соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации АЛК и измеряется фотометрически при длине волны 553 нм (540–560 нм).

1. п-Диметиламинобензальдегид (2 г) – 1 флакон;

2. Смесь кислот (уксусная кислота, 14 моль/л, хлорная кислота 0,92 моль/л) – 1 флакон (100 мл);

3. Буфер (ацетат натрия-уксусная кислота 2,0 моль/л, рН 4,6) – 1 флакон (50 мл);

4. Метилацетоацетат – 1 флакон (10 мл);

5. Экстрагент (этилацетат) – 2 флакона (по 75 мл);

6. Калибровочный раствор АЛК, 30 мг/л – 1 флакон (5 мл). 

Чувствительность определения не более 2 мг/л. 

При работе с данным набором необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (М., 1981г.). Операцию инкубации пробирок с образцами в кипящей водяной бане следует проводить в вытяжном шкафу. Реактив Эрлиха содержит уксусную и хлорную кислоты – едкие вещества. В случае попадания раствора на кожу и слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается. При попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.

– Спектрофотометр, длина волны 553 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 540–560 нм, кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;

– водяная баня, обеспечивающая температуру +100±1° С;

– центрифуга лабораторная на 3000 об/мин;

– секундомер; – вода дистиллированная;

– пипетки, позволяющие отбирать соответствующие объемы жидкости;

– шейкер;

– пробирки центрифужные вместимостью 5–10 мл. 

Реактив Эрлиха: Содержимое флакона с п-диметиламинобензальдегидом количественно перенести во флакон с раствором кислот и растворить при перемешивании. 

Компоненты реакционной смеси внести в пробирки в количествах, указанных в таблице 1.

Таблица 1

Содержимое пробирок тщательно перемешать, пробирки закрыть колпачками из алюминиевой фольги и поместить точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охладить в потоке холодной воды. В каждую пробирку прилить по 1,5 мл экстрагента (этилацетата). Пробирки плотно укупорить и перемешать на шейкере в течение не менее 30 сек. или встряхнуть вручную 50 раз. Затем каждую пробирку центрифугировать 5 минут при 3000 об/мин (1800 g). Отобрать 1,0 мл экстракта (верхнего слоя) и перенести в чистую пробирку. Прибавить 1,0 мл реактива Эрлиха и тщательно перемешать. Реакцию на АЛК следует считать положительной, если через 10 минут после добавления реактива Эрлиха произошло изменение окраски (розовое или красное окрашивание) по сравнению с холостой (желто-бурая окраска) и калибровочной пробами. Калибровочная проба, с учетом разведения, соответствует 6 мг/л АЛК. В случае положительной реакции рекомендуется провести количественное определение АЛК. 

Компоненты реакционной смеси внести в пробирки в количествах, указанных в таблице 2.

Таблица 2

Содержимое пробирок тщательно перемешать, пробирки закрыть колпачками из алюминиевой фольги и поместить точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охладить в потоке холодной воды. В каждую пробирку прилить по 3,0 мл экстрагента (этилацетата). Пробирки плотно укупорить и перемешать на шейкере в течение не менее 30 сек. или встряхнуть вручную 50 раз. Затем каждую пробирку центрифугировать 5 мин при 3000 об/мин (1800 g). Отобрать 2,0 мл экстракта (верхнего слоя) и перенести в чистую пробирку. Прибавить 2,0 мл реактива Эрлиха, содержимое пробирок тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18-25° С) в течение 10 минут. 

Измерить величины оптических плотностей:

– пробы C против пробы A – ( E_CA)

– пробы D против пробы B – ( E_DB)

– пробы E против пробы B – ( E_EB)

при 553 (540–560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Окраска устойчива в течение 1 часа.

Концентрацию АЛК рассчитать по формуле (1):

           E_EB  -  E_CA

           E_EB  -  E_DB

где: С - концентрация АЛК в опытной пробе, мг/л;

       6 – концентрация АЛК в калибровочном растворе, с учетом разведения, мг/л.

Набор следует хранить в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–25° С в течение всего срока годности. Срок годности – 2 года. Для качественного определения АЛК реактив Эрлиха устойчив при хранении в плотно укупоренном виде при температуре +2–8° С не более 3 суток. Для количественного определения использовать свежеприготовленный реактив Эрлиха. Буфер, Метилацетоацетат и Экстрагент после вскрытия флаконов могут храниться в укупоренном виде при температуре +2–25 °С в течение 1 года, но не более срока годности набора. Калибратор после вскрытия флакона может храниться в плотно укупоренном виде при температуре +2–8° С в течение 1 года, но не более срока годности набора.