Автор: И.В.Смирнов, Г.Н.Кольцова, В.В.Гладун, А.А.Левина.

Определение иммуноглобулинов на поверхности эритроцитов
 с использованием гелевого теста

Гематологический Научный Цент РАМН, Москва, ИЧП «Агат», Москва.
(Клиническая лабораторная диагностика, 7/99, стр. 24—34.)

Определение иммуноглобулинов (Ig), находящихся на поверхности эритроцитов, необходимо как для дифференциальной диагностики анемий, так и для наблюдения за больными, получающими многократные трансфузии эритроцитарной массы. Наиболее значимым для развития аутоиммунного гемолиза является иммуноглобулин IgG, поскольку тепловые агглютинины принадлежат, в основном, к данному классу. Холодовые антитела (агглютинины), принадлежащие к классу IgM, встречаются значительно реже и диагностируются относительно легко.

До настоящего времени наиболее распространенным методом определения Ig на поверхности эритроцитов является прямая проба Кумбса. Однако, этот метод, основанный на применении реакции агглютинации, видимо, регистрирует только нерастворимый комплекс антиген-антитело (Ig-антиIg) который затем может вызвать агглютинацию; положительная реакция наблюдается лишь в тех случаях, когда на поверхности эритроцитов фиксировано более 500 молекул иммуноглобулинов [1]. В то же время, в организме достаточно часто образуются растворимые комплексы антиген-антитело, которые могут быть определены современными методами исследования: радиоимунным, иммуноферментным и реакцией связывания комплимента. Эти методы, хотя и являются принципиальными аналогами прямой реакции Кумбса, значительно более чувствительны [2]. Их недостатком является сложность в исполнении и продолжительность реакции. Кроме того при использовании этих методов определяются антитела, связанные не только с тепловыми агглютининами, но и те иммуноглобулины, которые присоединяются к эритроцитам в результате каких-либо нарушений в их мембране, что характерно для таких состояний, как сепсис, вирусная или бактериальная инфекции, эндокринные нарушения [3].

В последние годы фирма Diamed (Швейцария) разработала гелевый тест, дающий возможность быстро и точно определять иммуноглобулины на поверхности эритроцитов [4]. Принцип метода состоит в использовании биогеля, соединенного со специфическими антителами. При нанесении на гель пробы эритроцитов, имеющих антигены данных антител, образуется комплекс антиген-антитело, который удерживает эритроциты на поверхности геля при последующем центрифугировании (по принципу афинной хроматографии). Количество антигена пропорционально величине образуемого комплекса, поэтому можно судить о количестве молекул Ig на поверхности эритроцитов по распределению эритроцитов в геле.

Рис.1. Контейнер с пробирками фирмы «Diamed»
с результатом анализа эритроцитов с различным количеством Ig на поверхности


Тест-набор представляет собой небольшой контейнер с тремя пробирками, содержащими гели с антителами разных типов (IgG, IgA и IgM). Для проведения анализа используется специальная низкоскоростная центрифуга на 100g и компьютер для считывания результата. В настоящее время фирма Diamed выпускает аналогичные тест-системы для определения групп антигенов при серповидно-клеточной анемии и других эритроцитарных антигенов (рис.1). Единственным недостатком этого метода является высокая стоимость наборов.

Поэтому мы предприняли попытку разработать свой гель и отработать проведение определения на доступном отечественном оборудовании.

В качестве носителя была использована смесь гелей Biogel P-300 (BioRad, США) и Sephadex G-100 (Pharmacia, Швеция). К нему, с помощью глютарового диальдегида в присутствии желатины, были пришиты различные антитела — IgG, IgA и IgM. Полученные гели суспендировали в растворе фикол-верографина с плотностью 1,08 г/см3.

Непосредственно перед анализом, суспензия геля должна быть тщательно перемешана. 0,5 мл суспензии помещали в пластиковую пробирку типа «Эпиндорф» вместимостью 0,6 мл, и после того, как гель осядет, на его поверхность наслаивали 10 мкл образца исследуемой крови. Пробирки центрифугировали на центрифуге ОП-3 при 1000 об/мин в течение точно 60 секунд.

Результаты оценивали визуально. При положительной реакции красное кольцо эритроцитов после центрифугирования остается на поверхности геля, что соответствует «++++»; при более слабых положительных реакциях эритроциты распределяются по гелю в зависимости от количества молекул Ig на эритроцитах: если эритроциты находятся в верхней части геля — это соответствует «+++», в средней части — «++» или «+». При отрицательной реакции, т. е. при отсутствии Ig на эритроцитах, они оседают на дне пробирки (рис. 2, 3).

Рис.2. Микропробирки с разработанным нами гелем и эритроцитами доноров и больных

(1) отрицательная реакция
(2) следы
(3) +
(4) + +
(5) от ++ до + + +
(6, 7) + + + +


Рис.3. Схема учета результатов гелевого теста

Положительная реакция 

+ + + +


+ + + 

                                    + +                                                      + 

Отрицательная реакция



Мы провели сравнительный анализ использования нашего гелевого теста и иммуноферментного определения Ig на эритроцитах доноров и гематологических больных с гемолитическими анемиями различной этиологии (АИГА, МДС, гемоглобино- и ферментопатии). Всего обследовано двумя методами 140 обльных и 20 доноров, полученные результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, для геля с антителами к IgG результат «++++» соответствует очень высокому уровню Ig на эритроцитах (более 2000 молекул/эритроцит); «+++» соответствует уровню 2000—500 мол./эритр.; «++» и «+» — 500—200 мол./эритр.; «следы» — 150—200 мол./эритр. Отрицательные результаты в обоих методах совпадали. Та же тенденция наблюдается и в отношении IgA и IgM.

Результаты определения Ig на эритроцитах в гелевом тесте
и методом иммуноферментативного анализа (ИФА)

Проба	IgG		IgA		IgM
	ИФА (мол./эритр.)	Гель-тест	ИФА (мол./эритр.)	Гель-тест	ИФА (мол./эритр.)	Гель-тест
1	1500	+++	20	-	60	++++
2	2500	++++	40	-	55	++++
3	100	-	10	-	5	-
4	3800	++++	60	следы	12	+
5	550	+++	80	+++	2	-
6	48	-	22	-	80	++++
7	1850	+++, ++++	45	следы	2	-
8	150	следы	18	-	32	++
9	668	+++	125	+++	25	+++
10	448	++	220	++++	45	+++
Соответствие значений для двух методов
	до 100	-	до 40	-	до 5	-
	150-200	следы	40-50	следы	5-10	следы
	200-500	+	50-80	+	10-20	+
	500-800	++	80-100	++	20-40	++
	800-2000	+++	100-200	+++	40-60	+++
	> 2000	++++	> 200	++++	>60	++++

Таким образом, представленный метод согласуется с результатами, полученными иммуноферментным методом. В то же время, он прост и доступен в исполнении, в связи с чем его можно применить в любой лаборатории. Кроме того, он может быть применен при определении совместимости эритроцитов донора с кровью реципиента при использовании многократных гемотрансфузий больным гематологическими заболеваниями.

Литература:
1. Leikola J., Perkins H.A., Enzyme-linked antiglobulin test: an accurate and simple method to quantity red cell antibodies. — Transfusion, 1980, v.20, № 2, p. 138—144.
2. Sokol R.J., Hewitt S., Brooker D.J. et al, An enzyme-linked direct antiglobulin test for assessing erythrocytebound in immunoglobulins. — J. Immunol. methods, 1988, v.106, p.31—35.
3. Sokol R.J., Hewitt S., Brooker D.J., Bailey A., Red cell autoantibodies, multiple immunoglobulin classes and autoimmune hemolysis. — Transfusion, 1990, v.30, p. 714-717.
4. Present and Future of the Sel Test, First International Symposium, Montreux, 1993.

Назад к списку